近年来，腺相关病毒（AAV）因其致病性低、基因表达持久等优势，已成为基因治疗领域最重要的递送载体之一。当前，已有多款基于重组腺相关病毒（rAAV）的基因治疗产品在欧美获批，用于治疗遗传性失明、血友病和肌营养不良等疾病。

然而，与临床需求的快速增长相比，rAAV 的规模化生产与纯化工艺仍是制约产业发展的核心瓶颈之一。

本文将聚焦 rAAV 的纯化技术路线，系统梳理不同生产体系对下游工艺的影响，以及近年来在捕获、精纯和放大方面的关键进展。

rAAV 的生产方式决定了纯化难度

AAV 本身是一种无囊膜、单链 DNA 病毒，无法自主复制，必须依赖辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）。rAAV 在此基础上进一步去除了 Rep 和 Cap 基因，仅保留衣壳并携带治疗性转基因，从而具备更高的安全性，但也无法在生产体系中自我扩增。

目前主流的 rAAV 生产体系主要包括：

1. HEK293 细胞瞬时转染体系：这是最常见的实验室与早期工艺路线，通过多质粒转染表达 Rep/Cap、辅助基因及转基因。该方法灵活性高，但产量低、空壳比例高（常超过 80%），对下游纯化提出了极高要求。

2. 昆虫细胞-杆状病毒体系：该体系具备良好的放大潜力，曾用于首个获批 rAAV 药物 Glybera® 的生产。但其缺点是缺陷颗粒和非感染性病毒比例较高，纯化难度依然显著。

3. 重组疱疹病毒（rHSV）体系：利用 HSV 天然的辅助病毒功能，可实现高滴度、高质量 rAAV 生产。但该体系对起始物料制备要求高，且必须在下游中彻底去除具有神经毒性的 HSV 残留。

4. 稳定生产细胞系：通过构建稳定表达 Rep/Cap 的细胞系，再用腺病毒诱导表达。该方法重复性和放大性较好，但仍需严格去除残留腺病毒和宿主 DNA。

总体而言，上游生产方式的选择直接决定了下游纯化的复杂度和成本结构。

rAAV 下游纯化的核心挑战

无论采用何种生产体系，rAAV 纯化均需面对以下共性难题：

• 病毒滴度低

• 完整衣壳与空壳结构高度相似

• 辅助病毒、宿主 DNA 和蛋白残留复杂

• 纯化过程损耗大、放大难度高

• 尚未形成类似单抗那样的“标准化平台工艺”

因此，下游工艺往往成为限制 rAAV 成本与可及性的决定性因素。

rAAV 纯化的关键工艺步骤

1. 细胞收获与裂解：小规模研究中常采用冻融法，但在工业规模下，更常使用裂解试剂处理或高压均质破碎技术，可在裂解细胞的同时剪切 DNA、降低黏度，利于后续澄清。

2. 澄清与初步浓缩：裂解液需去除细胞碎片和大颗粒杂质。当前主流方案包括：

• 深层过滤：温和、可放大

• 切向流过滤（TFF）：可实现约 10 倍浓缩，同时去除可溶性杂质，已成为 rAAV 工艺中的“标配步骤”

3. 病毒捕获：早期使用碘克沙醇或 CsCl 密度梯度超速离心，但该方法劳动强度大、通量低、不适合放大，且 CsCl 会损伤衣壳。目前主流方案为亲和层析，利用 AAV 衣壳特异性配体进行捕获。层析方法具有高选择性和高回收率，但成本高、载量有限，且多为血清型特异性。

近年来的新进展包括：

• 跨血清型配基（如 AAVX，可覆盖 1–9 型）

• 基于 AAV 受体的生物学配体

• 计算设计的多肽配体，具备成本低、洗脱条件温和的潜力

• 水相双相体系（ATPS），利用物理化学差异实现温和分离

• 空间排阻层析（SXC），结合 PEG 分子拥挤效应和亲水膜，载量可显著高于传统亲和填料

4. 精纯纯化：去除空壳的关键：捕获步骤无法区分完整衣壳与空壳，因此精纯步骤是 rAAV 工艺的核心难点。

当前最常用的方法是：

• 离子交换色谱（IEX）（阴/阳离子交换，常串联使用）

• 通过微小的表面电荷差异区分满壳、空壳和部分装载颗粒

此外，新兴技术还包括：

• 整体柱（Monolith column）：连续多孔结构，大幅提高流速

• 膜层析：高通量、低剪切、感染性保持良好

虽然超速离心仍可用于实验室或小规模生产，但其产率低、不可放大，在商业化生产中逐步被柱层析替代。

行业展望：从“可行”走向“可规模化”

与早期临床阶段相比，rAAV 纯化技术已取得显著进步。完整衣壳回收率已从早期不足 10% 提升至约 60%，这主要得益于层析材料与工艺设计的持续优化。

当前的发展趋势包括：

• 捕获与精纯层析的进一步放大

• 膜技术与连续工艺的应用

• 更高分辨率的分析手段

• 借鉴单抗与重组蛋白领域的成熟经验

尽管 rAAV 在结构与工艺上具有自身独特挑战，但在临床需求和资本推动下，纯化技术正成为推动基因治疗产业化的关键创新高地。可以预见，随着材料、设备和工艺集成能力的不断提升，rAAV 的规模化、可负担生产将逐步成为现实。