细胞培养，是指在体外（活体生物体外）培养和维持活细胞。自1906年罗斯·格兰维尔·哈里森首次在试管中培养青蛙神经纤维以来，细胞培养已成为生命科学研究中一项必不可少的技术。在过去的一个世纪里，它在科学知识和理解的巨大飞跃中发挥了作用，包括诱导多能干细胞的发展、基因编辑和疫苗的开发。

如今，细胞培养的应用范围广泛，涵盖基因工程、药物开发和疫苗生产。尽管基础概念和方法保持不变，但该技术已远远超越了充满血液和琼脂的试管。3D细胞培养模型和器官芯片等新兴技术能够模拟复杂的多细胞器官和细胞相互作用，从而尽可能真实地模拟人体在正常发育和患病状态下的生理机能。

然而，即使细胞培养的核心概念保持不变，成功细胞培养的主要障碍也保持不变：污染。不幸的是，对于细胞培养科学家来说，细胞生长的条件（富含营养的培养基、氧气、二氧化碳）也是许多污染物滋生的条件。虽然体内细胞受到免疫系统的保护，但细胞培养瓶中没有免疫反应，因此细胞容易受到机会性病原体和污染物的侵害。污染会对细胞产生重大影响，包括减缓细胞生长、改变形态和增加死亡率，所有这些都会对所进行的任何实验和收集的数据产生连锁反应。在这里，我们将讨论不同类型的细胞培养污染，如何尽快识别和处理污染，以及如何完全预防污染，以确保您的细胞保持健康和正常状态。 

细胞培养污染的类型

   -支原体污染

   - 细菌污染

   - 真菌污染

   - 酵母污染

   - 霉菌污染

   - 病毒污染

   - 其他类型的污染

细胞培养污染的类型

多种不同类型的微生物会污染细胞培养物，包括细菌、真菌、病毒和支原体。其中一些微生物，例如霉菌污染，可能很明显，因此很容易被发现；而另一些微生物，例如支原体，则可能长期潜伏在检测不到的地方。细胞系也可能被其他细胞系污染，随着时间的推移，这些细胞系可能会胜过并取代原始细胞。了解每种潜在的污染类型是去除污染物和防止未来有害入侵的关键。

支原体污染

支原体是细胞培养实验室中最常见的污染物之一，也是最难发现的污染物之一，因为它们在标准光学显微镜下无法观察到。支原体是一种微小的原核生物，缺乏细胞壁，基因组非常小（约 800 kbp，而细菌的平均基因组为 5 mbp）。 尽管存在差异，但支原体种被认为是由革兰氏阳性细菌退化进化而来的，并且保留了独立于其他细胞进行复制的能力。 

细胞培养中最常见的支原体种类是发酵支原体、口腔支原体和精氨酸支原体。污染源通常是动物源性试剂、操作人员交叉污染，甚至是操作人员本身。支原体污染是组织培养中的一个严重问题，广泛的筛查表明，所有连续细胞系中有 15% 到 35% 感染了支原体，而细胞系在实验室之间的频繁流动为支原体传播提供了充足的机会。

虽然支原体污染不会在受感染的培养物中产生任何可见或形态学症状，但它会对细胞功能产生深远的影响，包括基因表达、蛋白质合成以及分泌和代谢的变化。反过来，这会显著影响使用受污染细胞进行的实验所产生的数据的质量和可靠性，甚至改变癌细胞系对化疗的反应。

即使已确认支原体污染，也极难根除：支原体缺乏细胞壁，无法被许多标准组织培养抗生素所穿透，而其体积小巧，又能通过大多数过滤器。因此，最好定期筛查污染情况，尤其是在实验室引入新的细胞系时。 

细菌污染

细菌污染是另一种常见的细胞培养污染类型。由于细菌在大多数环境中普遍存在，它们很容易通过不良的无菌技术或使用前用于加热培养基的受污染水浴进入培养物。常见的细菌污染物包括大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、恶臭肠球菌和表皮葡萄球菌，它们要么在环境中常见，要么是正常人体微生物群的一部分。

细菌污染物在组织培养基的良好环境中可以快速繁殖，并且通常可以通过培养基的视觉变化轻松识别。大量的细菌群落会导致培养基pH值下降，使含有酚红指示剂的红色培养基变成粉红色。如果污染细菌是需氧菌，还会导致培养基浑浊，使其与正常的非贴壁细胞看起来不同。

真菌污染 

真菌污染物很容易污染无菌操作不当的细胞培养物，因为它们在环境中普遍存在，并且能够以孢子的形式长期存活。真菌污染通常由霉菌或酵母菌引起。

酵母污染

酵母是通过出芽繁殖的单细胞真核生物。大多数酵母的复制速度比微生物细胞快，因此它们能够迅速在营养丰富的环境中与细胞培养物竞争。初始污染通常不会引起颜色变化，但严重污染会导致培养基浑浊。酵母在培养物中呈椭圆形，通常比培养细胞小，可以通过其“出芽”繁殖方式（形成细胞链）来识别。最常见的酵母污染形式是念珠菌。

霉菌污染

与单细胞生物污染不同，霉菌污染可能非常明显，至少在后期是如此。霉菌（例如常见的曲霉菌和青霉菌）是多细胞生物，可产生长而丝状的菌丝和大型菌落。在污染的早期阶段，它们可能呈现为白色、黄色或黑色的绒毛点，这些绒毛点会发展成漂浮在培养基中或附着在烧瓶壁上的大块毛茸茸的斑块。真菌孢子可以存活很长时间，几乎无处不在。它们通常通过空气传播感染培养物，污染的可能性随季节变化，因为空调或暖气的使用增加或空气中花粉含量高会增加霉菌污染的可能性。

病毒污染

病毒污染是最难检测的污染类型之一，因为病毒是专性细胞内生物，光学显微镜下无法观察到。有些病毒污染物，例如疱疹病毒和腺病毒，会导致可见的细胞死亡，而另一些病毒污染物（例如逆转录病毒）则是隐性污染物，会形成不影响细胞生长的慢性感染，如果不对已知物种进行特定的基因分析或电子显微镜检查，就极难识别。

与通常来自环境或操作人员的其他类型污染不同，病毒污染通常源自细胞系本身。例如，在20世纪50年代和60年代，从恒河猴中分离的用于脊髓灰质炎疫苗的肾细胞后来被发现受到了猿猴病毒40（SV40）的污染。在某些情况下，人类或人畜共患病毒（如人类免疫缺陷病毒 (HIV-1) 和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV)）的污染可能使科学家面临感染风险，因此需要比未受污染的细胞更高的生物安全水平。

其他类型的污染

虽然细菌、真菌、支原体和病毒是细胞培养污染最常见的形式，但也可能发生其他类型的污染（表1）。这些包括寄生虫、朊病毒、化学污染以及来自其他细胞系的交叉污染。 

表 1.其他类型的细胞培养污染。

如何识别细胞培养中的污染

在了解污染的具体表现之前，您需要了解细胞在健康培养中应呈现的状态。形态、粘附性、培养基浊度和颜色等方面的变化可能是污染的警示信号，可以帮助您确定最佳的检测、处理和监测方案。此外，了解污染源的可能来源有助于防患于未然（表 2）。寻找污染规律有助于识别潜在的微生物来源，例如脏水浴、新试剂或无菌技术失误。 

表 2.常见污染物、其来源以及如何检测。

如何消除细胞培养污染

最佳处理方案是立即处置所有受污染的培养物，并对可能接触过受污染培养物的任何物品进行消毒，包括水浴槽、培养箱、层流罩或二级安全柜。根据污染源的不同，可能还需要对试剂进行检测或处置，或者对工作人员进行再培训。

然而，在某些情况下，处理细胞系可能行不通。如果不可替代的细胞系受到污染，可以尝试消除或控制有害污染物——无论是细菌、真菌还是支原体。

1. 第一步是识别污染物：是细菌、支原体、真菌还是病毒？检测支原体、细菌和真菌的黄金标准是培养，但这可能需要几天时间——对于需要控制污染的情况来说，时间太长了。因此，可以使用PCR、DNA染色或测序等更快捷的方法。市售的支原体检测试剂盒也很容易买到。

2. 隔离受污染的培养物并用适当的消毒剂彻底清洁实验室。

3. 某些处理方法可能对细胞有毒性，因此可能需要进行剂量反应测试。具体方法如下：收集受污染的细胞悬液，按标准稀释度接种到新鲜的培养板或培养瓶中，然后加入不同浓度的适当抗生素或抗真菌药物（表2）。观察细胞是否出现毒性迹象（例如生长不良、脱落和变圆），持续数天。

4. 一旦确定了潜在毒性，就可以在含有适当浓度的抗菌剂的培养基中培养细胞系两到三代。

5. 将细胞在不含抗生素的培养基中培养一次，然后在处理过的培养基中培养两到三次。

6. 将细胞在不含抗生素的培养基中培养数代，以确定污染是否已被清除。如果仍然有污染迹象，请重复步骤4-5。
        
        

何时以及如何使用细胞培养抗生素 

抗生素可用于清除细菌或支原体污染，但许多实验室也将其作为标准培养基的预防措施。在使用前，将青霉素和链霉素等抗生素混合物添加到培养基中，以防止细菌污染。在某些情况下，预先使用抗生素可能有用（例如，用于原代细胞培养、关键实验或转基因细胞的筛选）。然而，过度使用或误用抗生素可能会产生副作用。持续使用抗生素会造成一种虚假的安全感，导致人们在实施良好的无菌技术时掉以轻心。一项重要研究发现，持续使用抗生素的细胞培养物中的支原体污染比未使用抗生素的细胞培养物高出十倍。此外，持续使用抗生素会导致生长缓慢的抗生素耐药性生物的污染，这些生物会引起细胞行为的细微变化，但难以识别或消除。 

在细胞培养中长期使用抗生素也会影响细胞本身。研究表明，青霉素和链霉素等抗生素治疗会影响基因表达，可能改变细胞行为，例如分化和蛋白质去磷酸化，而利福平则可能诱导全基因组变化。因此 ，应仔细考虑在细胞培养中长期使用抗生素的副作用，尤其是在敏感性研究中，良好的无菌技术可以达到同样的效果。

如何避免细胞培养污染 

虽然某些形式的污染有可用的处理方法，但这可能非常耗时，并且会对之前使用同一细胞系进行的实验数据产生质疑。严重污染的细胞系可能需要被丢弃，以防止其扩散到实验室中的其他细胞系。对于受污染的原代细胞系，可能需要销毁所有受感染的原代细胞系。因此，在几乎所有情况下 ，预防肯定胜于治疗。

可以采取多种途径防止污染，这些措施应在新细胞系抵达实验室后立即启动。新细胞系是最常见的污染源之一，所有新细胞系都应隔离在单独的实验室或二级安全柜中，并在引入普通实验室之前进行常见污染物（例如细菌和支原体）检测。如果可能，还应检测细胞系以确认其身份。一旦在实验室中建立了细胞系，就应定期进行常规污染检测等质量控制。任何动物源性试剂（例如FBS）都应在使用前进行处理，例如用紫外线（UV）照射。

许多实验室使用青霉素和链霉素等抗生素混合物作为细胞培养基的标准，但正如前文所述，这些混合物可能会产生负面影响。总而言之，预防细胞培养污染的最佳方法是让训练有素的工作人员在清洁、维护良好的实验室中，严格遵守良好的无菌操作技术。

细胞培养中对无菌技术的需求自该方法问世之初就已显而易见。哈里森的研究曾因反复出现的细菌污染而面临挑战——直到他采用了无菌技术。

良好的无菌技术以及正确使用经认证的通风橱对于高效、无污染的细胞培养实验室至关重要。此外，经过培训能够在早期发现污染的操作人员可以通过尽早处理污染来帮助控制任何微生物的传播。全面的清洁计划也是防止污染的重要因素，因为它可以减少实验室内的环境微生物数量。层流罩和通风橱每次使用后都应进行消毒，例如使用乙醇和紫外线消毒。用于加热培养基或解冻试剂的水浴应定期清洁和消毒，任何溢出物或废弃物都应进行消毒并妥善处理。任何进入通风橱的设备都应用乙醇或其他合适的消毒剂擦拭，细胞培养物直接接触的所有物品都应为一次性无菌物品。

通过训练有素的员工、洁净的实验室和常规的污染监测，可以最大限度地降低污染风险，并维持实验室中充满健康、无污染的细胞培养。